產品及特點:
仙鶴草LAMP鑒定試劑盒是放線菌的一種，常常會在耳部等引起感染，感染具有多發性、復發性等特點，難以完全治愈，對人體健康造成較長時間的損害，因此檢測仙鶴草LAMP鑒定試劑盒具有重要的意義。本試劑盒根據熒光定量PCR 原理開發，它具有下列特點：
1. 即開即用，用戶只需要提供 DNA 模板。
2. 特異性高，引物是根據仙鶴草LAMP鑒定試劑盒高度保守區設計,不會擴增其他細菌。
3. 引物和擴增體系經過優化，靈敏性比常規 PCR 高 100 倍。
4. 提供無傳染性的 PCR 陽性對照，便于區分假陰性樣品。
5. 一管式操作，熒光 PCR 檢測，不容易產生環境污染。
6. 本產品只能用于科研，本試劑盒足夠 50 次 20μL 體系的 PCR。
組成及試劑配制:
1、酶標板：一塊（96孔）
2、 標準品（凍干品）： 2瓶，請臨用前15分鐘內配制。每瓶以樣品稀釋液稀釋至0.5ml，蓋好后室溫靜置大約10分鐘，同時反復顛倒/搓動以助溶解，其濃度為200 U/L，然后做系列倍比稀釋（注：不要直接在板中進行倍比稀釋），分別配制成200 U/L，100 U/L，50 U/L，25 U/L，12.5 U/L，6.25 U/L，3.12 U/L，樣品稀釋液直接作為空白孔 0 U/L。如配制100 U/L標準品：取0.3ml （不要少于0.3ml ）200 U/L的上述標準品加入含有0.3ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可，其余濃度以此類推。
3、 樣品稀釋液：1×20ml。
4、 檢測稀釋液A：1×10ml。
5、 檢測稀釋液B：1×10ml。
使用方法：仙鶴草LAMP鑒定試劑盒一、制備標準曲線樣品（以 10E2-10E7 拷貝/μL 這 6 個 10 倍稀釋度為例）。由于標準品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區域進行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產品穩定性和避免擴散傳染性病原，本產品不提供活體樣品做陽性對照，只提供無傳染性的 DNA 片段作為陽性對照。
1. 標記 6 個離心管，分別為 7，6，5，4，3，2。
2. 用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 PCR 專用模板稀釋液，最好用帶芯槍頭，下同）。
3. 在 7 號管中加入 5 μL 陽性對照（其濃度為 1×10E8 拷貝/μL，試劑盒提供)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E7 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。
4. 換槍頭，在 6 號管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E6 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。
5. 換槍頭，在 5 號管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E5 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。
6. 重復上面的操作直到得到 6 個稀釋度的標準曲線樣品。放冰上待用。
二、樣品 DNA 的制備
7. 用自選方法純化樣品的 DNA，本產品跟市場上絕大多數核酸純化產品兼容。
8. 如果有 N 個樣品，則需要進行 N+2 個樣品提取，多出的一個用作樣品制備陽性對照管、另一個用作樣品制備陰性對照管。
三、設置 qPCR 反應（20μL 體系，在樣品制備室進行）
9. 如果進行定量分析，則標記 N+9 個 PCR 管，其中 N+2 個用于上步得到的N+2 個樣品，1 個用于 PCR 陰性對照，6 個用于標準曲線樣品。如果做定性分析，則 6 個標準曲線樣品只選一個做（可以選 4 號，其余樣品不變）。
數據處理11. 如果把本試劑盒用于定量檢測，則以陽性對照濃度的 log 值為橫軸，以 Ct值為縱軸，繪制標準曲線。再以待測樣品的 Ct 值從標準曲線上推算出樣品DNA 濃度的 log 值，再推算出其濃度。
12. 如果把本試劑盒用于定性檢測，只判斷陽性或陰性，則陰性對照 Ct 必須大于或等于 30。陽性對照必須有熒光對數增長，有典型擴增曲線，Ct 值應該小于或等于 25。對待測樣品，如果其 Ct 大于或等于 30 則為陰性，如果小于或等于 25 則為陽性。如果在 25-30 之間，則重復一次。重復實驗的 Ct值如果大于或等于 30 則為陰性，如果小于 30，則為陽性
原創作者：上海莼試生物技術有限公司
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