中文名稱：Protein A/G免疫沉淀磁珠試劑盒
英文名稱：Protein A/G Immunoprecipitation Kit
產品規格：20次/100次
發貨周期：1～3天
產品簡介：
Protein A/G Matrix免疫沉淀磁珠及試劑盒系列產品是利用納米表面技術使Protein A/G高密度定向包被到超順磁性微球表面，與當前國際免疫磁珠市場上同類產品相比，該產品具有更多的抗體結合位點，磁珠使用量更少，非特異性結合率低，可便捷高效地進行免疫沉淀實驗。每毫升免疫沉淀磁珠結合Human IgG的能力可達到300 μg以上，單個沉淀反應僅需25 μL磁珠即可完成檢測。微米級磁珠提供的超大比表面積，大幅縮短抗體與抗原吸附所需的平衡時間，15 min內即可完成抗體吸附過程，30 min內完成抗原沉淀操作。簡短的操作時間避免長時間操作造成目標蛋白水解，保證了目標蛋白的活性及蛋白復合物的完整性。
免疫沉淀磁珠試劑盒配有經過優化預制的緩沖液，為免疫沉淀實驗提供了最佳的反應條件，增強了免疫沉淀實驗的穩定性。
本產品可廣泛應用于細胞裂解物、細胞分泌上清、血清、腹水等樣品中抗原的免疫沉淀反應。操作者可以參考本操作說明書，附表1的數據了解不同種屬來源及亞型的抗體與Protein A磁珠、Protein A/G的結合能力。
儲存條件：2～8℃保存
保存期：1年
注：磁珠結合Human IgG能力(Antibody Capacity)分別為：Protein A：0.4～0.5 mg/mL; Protein A/G：0.5～0.6 mg/mL
操作流程：
1. 抗原樣品制備：本操作說明書提供以下四種樣品處理方法，建議您根據不同來源的抗原樣品選擇適當的方式進行預處理，使待檢測抗原釋放至樣品溶液中。
血清樣品處理：若目標蛋白豐度較高，建議用結合緩沖液(②)稀釋血清樣品至目標蛋白終濃度為10～100 μg/mL，置于冰上備用(或置于-20℃長期保存)。
懸浮細胞樣品處理：離心收集細胞(4℃，500 g，10 min)，棄上清后稱重，按每毫克細胞50 μL的比例用1× PBS(③)洗滌2次；按每毫克細胞5～10 μL 的比例加入結合緩沖液(②)，同時加入蛋白酶抑制劑(如終濃度為1 mM 的PMSF)，混勻后置于冰上處理10 min；離心收集上清液(4℃,14000 g,10 min)，置于冰上備用(或置于-20℃長期保存)。
貼壁細胞樣品處理：移去培養基，按每1.0×105個細胞150 μL的比例用1×PBS(③)洗滌兩次；用細胞刮棒刮脫細胞，收集至1.5 mL EP管內，按每1.0×105個細胞20～30 μL 的比例加入結合緩沖液(②)，同時加入蛋白酶抑制劑(如終濃度為1 mM的PMSF)，混勻后置于冰上處理10 min；離心收集上清液(4℃，14000 g，10 min)，置于冰上備用(或置于-20℃長期保存)。
大腸桿菌樣品處理：離心收集大腸桿菌(4℃，12000 g，2 min)，棄上清后稱重，按每克(濕重)菌體 10 mL的比例用1×PBS(③)洗滌2次；按每克(濕重)菌體5～10 mL的比例加入結合緩沖液(②)，同時加入蛋白酶抑制劑(如終濃度為1 mM 的PMSF)，重懸菌體，超聲裂解細胞，離心收集上清(4℃，17000 g，10 min)。
2. 磁珠預處理：將免疫沉淀磁珠(①)漩渦振蕩1 min，使磁珠充分振蕩重懸；取25～50 μL磁珠懸液置 于1.5 mL EP管中。加入200 μL 結合緩沖液(②)洗滌，進行磁性分離［將EP管放置于磁性分離器(⑦)上，使磁珠被吸附在管壁至溶液澄清；該操作描述以下省略］，棄上清液，從磁性分離器上取下EP管，重復洗滌一次。最后加入200 μL 結合緩沖液(②)重懸磁珠以備用。
3. 抗體結合反應：
抗體工作液的制備：用結合緩沖液(②)稀釋抗體樣品，配制成終濃度為5～50 μg/mL抗體工作液，置于冰上備用。
抗體吸附：將步驟2預處理的磁珠懸液進行磁性分離，棄上清液；加入200 μL抗體工作液，迅速重懸后在室溫下置于翻轉混合儀或者手工輕輕翻轉EP管，15 min后進行磁性分離，收集上清液置于冰上以備后續檢測。
洗滌：向EP管中加入200 μL 結合緩沖液(②)洗滌，用移液器輕輕吹打使磁珠-抗體復合物均勻分散，然后進行磁性分離，棄上清液，從磁性分離器上取下EP管。重復以上洗滌操作一次。
4. 抗體交聯反應 (備選)：如操作者需要將抗體和目標抗原復合物共同洗脫，請忽略本步驟，進行步驟5。
本步驟適用于操作者需要單獨洗脫目標抗原的試驗，推薦使用BS3(Thermo Scientific，Cat. #21580)作為交聯劑，相關實驗請參照該試劑的操作說明。
5. 抗原沉淀反應
抗原吸附：加入200 μL步驟1中制備的抗原樣品，用移液器輕輕吹打使抗原與磁珠-抗體復合物均勻分散。在室溫下置于翻轉混合儀或者手工輕輕翻轉EP管10 min，使抗原與抗體充分結合，如結合力較弱則可在室溫下反應1 h或者在4℃下反應過夜。
洗滌與轉移：將上述完成抗原吸附的磁珠-抗體-抗原復合物進行磁性分離，收集上清液置于冰上以備后續檢測。向EP管中加入200 μL洗滌緩沖液(④)洗滌，用移液器輕輕吹打使磁珠-抗體-抗原復合物均勻分散，然后進行磁性分離，棄上清液；從磁性分離器上取下EP管，再重復洗滌兩次。最后加入200 μL 洗滌緩沖液(④)，用移液器將磁珠-抗體-抗原復合物懸液轉移至新的1.5 mL EP管中*，并執行磁性分離，移棄上清。
(*注：抗原洗脫前務必將磁珠轉移到新的EP管，避免將管壁上原有的非特異性吸附蛋白一起洗脫。)
6. 抗原洗脫：本操作說明書提供以下兩種抗原洗脫方案，操作者可根據后期檢測的需要選擇不同的抗原洗脫方法。
變性洗脫法：此法洗脫的樣品適用于SDS-PAGE檢測。從磁性分離器上取下EP管，向其中加入25 μL 1×SDS-PAGE Loading Buffer(自備)混合均勻，95℃加熱5 min。然后執行磁性分離［也可以使用離心的方式(室溫下13000 g，10 min)］收集上清液進行SDS-PAGE檢測。
非變性洗脫法：此方法洗脫的樣品保持原有的生物活性，可用于后期功能分析。從磁性分離器上取下EP管，向其中加入20 μL洗脫緩沖液(⑤)混合均勻，室溫孵育10 min。然后執行磁性分離［也可以使用離心的方式(4℃，13000 g,10 min)］，收集上清液至新的EP管，并立即加入1.0 μL中和緩沖液(⑥)將洗脫產物pH調節至中性，用于后期功能分析。
注意事項：
1. 進行免疫沉淀操作之前，請務必認真閱讀本操作說明書。
2. 本產品須與磁性分離器配套使用。
3. 磁珠使用前應充分振蕩均勻。
4. 磁珠應保存在儲存溶液中，防止干燥。
5. 請勿將磁珠冷凍或離心，以免引起不可逆聚集。
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