中文名稱：ECM Kit(大鼠IgG)
英文名稱：
產品規格：1盒
發貨周期：1～3天
用途：適于一抗為大鼠IgG的Western Blotting 檢測。
保存條件：4℃可保存一年 。
實驗操作步驟：
1．蛋白質的樣品制備：
1)細胞培養蛋白質樣品的制備：
1：胰酶消化后裂解：細胞培養至 80%左右密度時，以含 0.25%胰蛋白酶消化,室溫，低速離心，棄上清。細胞經預冷的PBS 漂洗3次，加入 0.1-1ml 裂解液(根據細胞數量定)反復吹打。
2：皿上直接裂解：細胞培養至 80%左右密度時，細胞經預冷的PBS 漂洗3次，加入 0.1-1ml 裂解液(根據細胞數量定)，用細胞刮刀收集，轉移至離心管中，反復吹打。
2)組織樣品的制備：新鮮組織塊迅速置于預冷的生理鹽水中，漂洗數次，按組織凈重：裂解液=1：10的比例，加入相應體積的裂解液進行勻漿，離心收集上清(如有粘稠物可超聲處理)
3)蛋白變性：處理后的樣品加入樣品緩沖液(按樣品濃度 1：1或1：2的比例)混勻，樣品置 1000C的水浴箱加熱 3-5分鐘，10000g 離心 10分鐘，取上清液。(樣品可立即使用也可以分裝凍存，-20℃可穩定保持數月。)
2．SDS-PAGE 電泳：
1)．制 膠：①按比例配制分離膠(丙烯酰胺母液：單體：雙體=29：1)，緩緩地搖動溶液，使激活劑混合均勻，將凝膠溶液平緩地注入兩層玻璃極中，再在液面上小心注入一層水或正丁醇，以阻止氧氣進入凝膠溶液中，37℃恒溫箱中靜置 60min。
②同前按比例配制濃縮膠，但混勻溶液時不要過于劇烈以免引入過多的氧氣。吸去不連續系統中下層分離膠上的水分，以連續平穩的液流注入凝膠溶液，然后小心插入梳子并注意不得在齒尖留有氣泡，37℃恒溫箱中靜置60min 以上以保證完全聚合。
2)加 樣：依次加入標準品和待分析樣品。(加樣時間要盡量短，以免樣品擴散，可在未加樣的孔中加入等量的樣品緩沖液避免邊緣效應。樣品一般在 1.0mm 厚的膠 加樣 50-100ug/lane)。
3)電 泳：加樣完畢，選擇適當的電壓進行電泳即可。一般采用恒壓濃縮膠 55V，分離膠 75V，電泳直至溴酚藍染料前沿下至凝膠末端處，即停止電泳。
3．轉 膜：蛋白質經 SDS-PAGE 分離后，從凝膠中轉移到固相支持物上，常用的支持物有：硝酸纖維膜即 NC 膜(AR0135)或PVDF 膜。Tris/甘氨酸-SDS-PAGE 結束后，取出凝膠，在 Tris/甘氨酸緩沖液中漂洗數秒。蛋白質從凝膠向膜轉移的過程普遍采用電轉印法，包括濕式電轉印和干式電轉印。
1)干式電轉?。簩⑥D印槽陰極平放工作臺上，并在上面加三張電轉印液浸透的1mm厚的濾紙，將電轉印液浸透 0.45μm的N.C 膜放在濾紙上，再將凝膠平放在 N.C 膜上，最后在凝膠上加蓋三層電轉印液浸透 1mm 厚的濾紙，電流根據凝膠面積按 1-2 mA/cm2,接通電源，經 1-1.5 小時電轉印。
2)濕式電轉?。捍蜷_電轉印夾，每側墊上一塊專用的用轉印液浸泡透的海面墊，再各放三塊轉印液浸透的濾紙，濾紙與海面墊大小相同或與 NC 膜、凝膠大小相同均可，將凝膠平放在陰極側濾紙上，最后將 NC 膜平放在凝膠上，按照(-)夾板-海棉-濾紙-膠塊-NC 膜-濾紙-海綿-夾板(+)裝好,依次除盡每層間氣泡，夾好電轉印夾。 電泳槽加滿預冷電轉印液，插入電轉印夾，將電泳槽放入冰箱內，連接好電極，接通電流，轉印夾的NC 膜應對電泳槽的正極,4℃ 250-300mA,轉印 80min(根據
分子量不同，轉印時間可適當調整)。
4、膜的封閉：漂洗轉印膜,室溫，3次 x10min,以盡量洗去轉印膜上的SDS(以免影響抗體的結合)，放入 0.02M TBS 緩沖液配置的5%脫脂奶粉和 1%的BSA 混合的封閉液內，搖床搖動，室溫封閉 2h或4℃過夜。1×TBS-T ，PH7.6洗
液，室溫漂洗10min。
5、抗體雜交：1)封閉后的雜交膜放入雜交袋中，加入用 0.02M TBS 緩沖液配置的2%脫脂奶粉和 1%的BSA 混合的稀釋液適當稀釋的適當稀釋的一抗，4℃孵育過夜或37℃孵育2h，1×TBS-T ，PH7.6洗液洗膜 3次 x10min。(一抗的稀釋度，孵育時間，溫度與顯色強度，背景有直接關系。一般來說，陽性不強時可提高一抗濃度和延長孵育時間，而背景高，非特異性條帶多，則降低抗體濃度和孵育時間)。
2)用 0.02M TBS 緩沖液配置的2%脫脂奶粉和 1%的BSA 混合的稀釋液適當稀釋過氧化物酶標記兔抗大鼠IgG 孵育膜，20℃-37℃,1.5 小時或4℃過夜，1×TBS-T洗膜 3×10min。
6、顯色(ECM)
ECM顯色劑配制:按 1ml 蒸餾水，加顯色劑 A、B 各 1 滴混勻。將雜交后印跡膜放入顯色盒中,加上混合好的顯色液反應約 1-5分鐘。吸去印跡膜邊緣顯色液,將一透明的玻璃紙蓋住撫平,以確保×感光膠片的干燥。印跡膜轉入暗室中使膠片曝光 30＇-5分鐘。
7、顯影，定影。
13585831301
021-59541103 021-60443211
3004967995
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