中文名稱：ECM Kit(山羊IgG)
英文名稱：
產(chǎn)品規(guī)格：1盒
發(fā)貨周期：1～3天
用途：適于一抗為山羊IgG的Western Blotting 檢測(cè)。
保存條件：4℃可保存一年 。
Western Blotting 檢測(cè)試劑盒內(nèi)容：
1.封閉試劑：10g 蛋白質(zhì)干粉(脫脂奶粉)。
2.HRP 標(biāo)記兔抗山羊IgG：0.1ml 親和純化抗體，經(jīng)過(guò)人血清吸附以去除交叉抗體。
效價(jià) 1：2000-10000。
3.ECM 顯色劑：總量 10ml。含 A 液 5ml(×20倍)；B 液 5ml(×20倍)。每個(gè)試劑盒足夠 10 張小膜或800 c ㎡面積的膜顯色
工作原理：
蛋白質(zhì)的電泳分離是重要的生物化學(xué)分離純化技術(shù)之一,電泳是指帶電粒子在電場(chǎng)作用下 ,向著與其電荷相反的電極移動(dòng)的現(xiàn)象。根據(jù)所采用的支持物不同,可分為：瓊脂糖凝膠電泳、淀粉凝膠電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳等。其中以聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)最廣泛。它的優(yōu)點(diǎn)為：無(wú)電滲作用,樣品用量少(1-100μg),分辨率高,可檢出 10-9-10-12mol的樣品,凝膠機(jī)械強(qiáng)度大,重復(fù)性好以及可以通過(guò)調(diào)節(jié)單體濃度或單體與交聯(lián)劑的比例而得到孔徑不同的凝膠。SDS-PAGE 是最常用的定性分析蛋白質(zhì)的電泳方式,它根據(jù)蛋白分子大小不同，遷移速率的不同而達(dá)到分離目的，特別是用于蛋白質(zhì)純度檢測(cè)和測(cè)定蛋白質(zhì)分子量。
免疫印跡是將凝膠電泳的高分辨力和免疫化學(xué)檢測(cè)的特異性融為一體。免疫印跡技術(shù)首先借助凝膠電泳將蛋白質(zhì)抗原分離，然后將凝膠中的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印到膜上使之成為被分離的一個(gè)拷貝。免疫印跡為檢測(cè)樣品中是否存在目的蛋白提供一種可靠的方法，該法鑒定蛋白質(zhì)的原理是根據(jù)被測(cè)蛋白能與特異性抗體結(jié)合的特性并通過(guò)相對(duì)遷移率來(lái)體現(xiàn)該蛋白的分子量。如果想要了解樣品中是否存在某一抗原，以及該抗原的含量或該抗原多肽鏈的相對(duì)分子質(zhì)量以及亞型，是否與其他蛋白結(jié)合，蛋白質(zhì)的酪氨酸殘基是否發(fā)生磷酸化等有關(guān)問(wèn)題均可采用免疫印跡。
免疫印跡包括多個(gè)簡(jiǎn)單步驟，可在一到兩天完成，該方法具有高效，簡(jiǎn)便，靈敏等特點(diǎn)。
實(shí)驗(yàn)操作步驟：
1．蛋白質(zhì)的樣品制備：
1)細(xì)胞培養(yǎng)蛋白質(zhì)樣品的制備：
1：胰酶消化后裂解：細(xì)胞培養(yǎng)至 80%左右密度時(shí)，以含 0.25%胰蛋白酶消化,室溫，低速離心，棄上清。細(xì)胞經(jīng)預(yù)冷的PBS 漂洗3次，加入 0.1-1ml 裂解液(根據(jù)細(xì)胞數(shù)量定)反復(fù)吹打。
2：皿上直接裂解：細(xì)胞培養(yǎng)至 80%左右密度時(shí)，細(xì)胞經(jīng)預(yù)冷的PBS 漂洗3次，加入 0.1-1ml 裂解液(根據(jù)細(xì)胞數(shù)量定)，用細(xì)胞刮刀收集，轉(zhuǎn)移至離心管中，反復(fù)吹打。
2)組織樣品的制備：新鮮組織塊迅速置于預(yù)冷的生理鹽水中，漂洗數(shù)次，按組織凈重：裂解液=1：10的比例，加入相應(yīng)體積的裂解液進(jìn)行勻漿，離心收集上清(如有粘稠物可超聲處理)
3)蛋白變性：處理后的樣品加入樣品緩沖液(按樣品濃度 1：1或1：2的比例)混勻，樣品置 1000C的水浴箱加熱 3-5分鐘，10000g 離心 10分鐘，取上清液。(樣品可立即使用也可以分裝凍存，-20℃可穩(wěn)定保持?jǐn)?shù)月。)
2．SDS-PAGE 電泳：
1)．制 膠：①按比例配制分離膠(丙烯酰胺母液：?jiǎn)误w：雙體=29：1)，緩緩地?fù)u動(dòng)溶液，使激活劑混合均勻，將凝膠溶液平緩地注入兩層玻璃極中，再在液面上小心注入一層水或正丁醇，以阻止氧氣進(jìn)入凝膠溶液中，37℃恒溫箱中靜置 60min。
②同前按比例配制濃縮膠，但混勻溶液時(shí)不要過(guò)于劇烈以免引入過(guò)多的氧氣。吸去不連續(xù)系統(tǒng)中下層分離膠上的水分，以連續(xù)平穩(wěn)的液流注入凝膠
溶液，然后小心插入梳子并注意不得在齒尖留有氣泡，37℃恒溫箱中靜置60min 以上以保證完全聚合。
2)加 樣：依次加入標(biāo)準(zhǔn)品和待分析樣品。(加樣時(shí)間要盡量短，以免樣品擴(kuò)散，可在未加樣的孔中加入等量的樣品緩沖液避免邊緣效應(yīng)。樣品一般在 1.0mm 厚的膠 加樣 50-100ug/lane)。
3)電 泳：加樣完畢，選擇適當(dāng)?shù)碾妷哼M(jìn)行電泳即可。一般采用恒壓濃縮膠 55V，分離膠 75V，電泳直至溴酚藍(lán)染料前沿下至凝膠末端處，即停止電泳。
3．轉(zhuǎn) 膜：蛋白質(zhì)經(jīng) SDS-PAGE 分離后，從凝膠中轉(zhuǎn)移到固相支持物上，常用的支持物有：硝酸纖維膜即 NC 膜(AR0135)或PVDF 膜。Tris/甘氨酸-SDS-PAGE 結(jié)束后，取出凝膠，在 Tris/甘氨酸緩沖液中漂洗數(shù)秒。蛋白質(zhì)從凝膠向膜轉(zhuǎn)移的過(guò)程普遍采用電轉(zhuǎn)印法，包括濕式電轉(zhuǎn)印和干式電轉(zhuǎn)印。
1)干式電轉(zhuǎn)印：將轉(zhuǎn)印槽陰極平放工作臺(tái)上，并在上面加三張電轉(zhuǎn)印液浸透的1mm厚的濾紙，將電轉(zhuǎn)印液浸透 0.45μm的N.C 膜放在濾紙上，再將凝膠平放在 N.C 膜上，最后在凝膠上加蓋三層電轉(zhuǎn)印液浸透 1mm 厚的濾紙，電流根據(jù)凝膠面積按1-2 mA/cm2,接通電源，經(jīng) 1-1.5 小時(shí)電轉(zhuǎn)印。
2)濕式電轉(zhuǎn)印：打開(kāi)電轉(zhuǎn)印夾，每側(cè)墊上一塊專用的用轉(zhuǎn)印液浸泡透的海面墊，再各放三塊轉(zhuǎn)印液浸透的濾紙，濾紙與海面墊大小相同或與 NC 膜、凝膠大小相同均可，將凝膠平放在陰極側(cè)濾紙上，最后將 NC 膜平放在凝膠上，按照(-)夾板-海棉-濾紙-膠塊-NC 膜-濾紙-海綿-夾板(+)裝好,依次除盡每層間氣泡，夾好電轉(zhuǎn)印夾。 電泳槽加滿預(yù)冷電轉(zhuǎn)印液，插入電轉(zhuǎn)印夾，將電泳槽放入冰箱內(nèi)，連接好電極，接通電流，轉(zhuǎn)印夾的NC 膜應(yīng)對(duì)電泳槽的正極,4℃ 250-300mA,轉(zhuǎn)印 80min(根據(jù)分子量不同，轉(zhuǎn)印時(shí)間可適當(dāng)調(diào)整)。
4、膜的封閉：漂洗轉(zhuǎn)印膜,室溫，3次 x10min,以盡量洗去轉(zhuǎn)印膜上的SDS(以免影響抗體的結(jié)合)，放入 0.02M TBS 緩沖液配置的5%脫脂奶粉和 1%的BSA 混合的封閉液內(nèi)，搖床搖動(dòng)，室溫封閉 2h或4℃過(guò)夜。1×TBS-T ，PH7.6洗液，室溫漂洗10min。
5、抗體雜交：1)封閉后的雜交膜放入雜交袋中，加入用 0.02M TBS 緩沖液配置的2%脫脂奶粉和 1%的BSA 混合的稀釋液適當(dāng)稀釋的一抗，4℃孵育過(guò)夜或37℃孵育2h，1×TBS-T ，PH7.6洗液洗膜 3次 x10min。(一抗的稀釋度，孵育時(shí)間，溫度與顯色強(qiáng)度，背景有直接關(guān)系。一般來(lái)說(shuō)，陽(yáng)性不強(qiáng)時(shí)可提高一抗?jié)舛群脱娱L(zhǎng)孵育時(shí)間，而背景高，非特異性條帶多，則降低抗體濃度和孵育時(shí)間)。
2)用 0.02M TBS 緩沖液配置的2%脫脂奶粉和 1%的BSA 混合的稀釋液適當(dāng)稀釋過(guò)氧化物酶標(biāo)記兔抗山羊IgG 孵育膜，20℃-37℃,1.5 小時(shí)或4℃過(guò)夜,1×TBS-T洗膜 3×10min。
6、顯色(ECM)
ECM 顯色劑配制:按 1ml 蒸餾水，加顯色劑 A、B 各 1 滴混勻。將雜交后印跡膜放入顯色盒中,加上混合好的顯色液反應(yīng)約 1-5分鐘。吸去印跡膜邊緣顯色液,將一透明的玻璃紙蓋住撫平,以確保×感光膠片的干燥。印跡膜轉(zhuǎn)入暗室中使膠片曝光 30＇-5分鐘。
7、顯影，定影。 將曝光后的×感光膠片放入顯影液中沖洗至膠片上出現(xiàn)條帶或者膠片透明為止,再放入定影液中定影，膠片可長(zhǎng)期保存。
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021-59541103 021-60443211
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