英文名稱：DAB chromogenic reagent kit For Western Blotting
產品規格：1盒
發貨周期：1～3天
工作原理：聚合標記法是一種酶標記方法，其敏感性比普通酶標法有明顯提高。用于 Western Blotting的免疫學檢測，更能體現其優點。不僅能大量地節約一抗，更重要的是使條帶更清晰，甚至能檢測出普通酶標法無法檢測出的微量條帶。DAB 是過氧化物酶最重要的顯色劑之一，反應產物為不溶于水、二甲苯和醇的棕色沉淀物，適合于免疫印跡的顯色反應。本產品采用特殊配方，具有操作簡單，儲存穩定，信號靈敏度高，持續時間長，背景低，結果易保存等優點。
保存條件：－20℃冷凍保存。DAB 顯色試劑應避光保存。
有效期：一年。
試劑盒的內容：
(1)封閉試劑：10 g 蛋白干粉×2 包。
(2)濃縮抗體稀釋液：20 ml×1 瓶，為10倍濃縮液。
(3)聚合過氧化物酶標記山羊抗兔IgG0.2ml，效價 1：200-400。親和純化抗體，經聚合法標記過氧化物酶。
(4)DAB 顯色試劑，含：
顯色劑 A：DAB×40倍濃縮液，3ml。
顯色劑 B：H2O2×40倍濃縮液，3ml。
顯色劑 C：×40倍 TBS 濃縮緩沖液，3ml。
使用說明 需要而未提供的試劑和器材：
1．轉印了蛋白樣品的NC 膜或PVDF 膜：通過 SDS-PAGE 凝膠電泳分離蛋白質抗原，將 PAG 膠上的蛋白質轉印到硝酸纖維素膜(NC 膜)或PVDF 膜上。
2．稀釋緩沖液：使用中性稀釋緩沖液即 0.02 M PBS或0.02M TBS(AR0144)配制封閉液和抗體稀釋液。0.02 M PBS(pH7.2-7.6)：1000 ml 蒸餾水加 Na2HPO4 2.8 g ，NaH2PO4 0.4 g，NaCl 8.5 g。如果用的是含水磷酸鹽，應加上分子式中水的含量。0.02M TBS(pH7.2-7.6)：1000ml 蒸餾水中加 Tris 2.42g,NaCl 9g; 純乙酸或濃鹽酸調節 pH 值(7.2-7.6)。
3．洗滌緩沖液：每 1000ml 中性稀釋緩沖液中加入 0.5 ml Tween20 即可。
4．一抗：選擇適合的一抗，用抗體稀釋液稀釋相應的一抗，一般特異性抗體工作濃度為1μg/ml,具體的稀釋度取決于特異性的一抗和膜上的抗原的量。
5．搖床：膜的封閉、抗體孵育和洗滌都需平穩搖晃，需在搖床上操作。
6．相機：記錄結果。
操作程序：
1．通過聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白樣本和分子量標準。
2．將蛋白樣本轉移至硝酸纖維素膜或PVDF 膜上。
3．封閉硝酸纖維膜：用封閉蛋白干粉 2 g,加稀釋緩沖液 100 ml，20-37℃封閉 1-2 小時。用量以浸沒整張膜為準。
4．用洗滌緩沖液洗滌硝酸纖維素膜 5分鐘,1次。
5．配制抗體稀釋液：取 90 ml 稀釋緩沖液加 1 g 封閉蛋白干粉和 10 ml濃縮抗體稀釋液即可。一抗、二抗均用此稀釋液稀釋。
6．硝酸纖維膜孵育一抗：用抗體稀釋液稀釋相應的一抗，一般特異性抗體濃度 1μg/ml,20-37℃孵育2 小時左右。如果缺乏特異性的條帶或陽性不強，應提高一抗的濃度；如果有非特異性的條帶，應提高一抗的稀釋度。
7．用洗滌緩沖液振蕩洗滌硝酸纖維素膜 3次,每次 5分鐘。
8．硝酸纖維膜孵育二抗：用抗體稀釋液稀釋相應的酶標二抗，效價 1：200-400。37℃孵育一個半小時左右。用戶可根據實際染色情況對稀釋度做適當調整。
9．用洗滌緩沖液振蕩洗滌硝酸纖維膜 4次,每次 5分鐘。
10．DAB 顯色:使用 DAB 顯色試劑。按每 2 ml 蒸餾水加顯色劑 A，B，C 各１滴，混勻。混勻后加至膜上。室溫顯色。一般顯色 1－30分鐘。
若無背景出現則可繼續顯色。顯色后用蒸餾水洗滌以終止反應。
11．觀察，照相。
注意事項：
1．試劑頻繁使用時置４℃，不常使用時置－20℃。顯色劑 A 需置－20℃冷凍保存。如有結晶析出，應確保結晶完全溶解再行使用。
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021-59541103 021-60443211
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