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線粒體提取試劑盒用于從動(dòng)物細(xì)胞或組織中分離出完整而純化的線粒體。適合于動(dòng)物軟組織(肝或腦組織)和硬組織(肌肉)以及培養(yǎng)細(xì)胞的線粒體的制備。其制備物產(chǎn)量高，可以被用于細(xì)胞凋亡、信號(hào)傳遞、代謝和蛋白組學(xué)等的研究。

操作步驟：

1. 樣本處理：

a. 組織勻漿：稱(chēng)取100~200 mg新鮮組織如肝臟、腦、心肌等，PBS或生理鹽水沖洗，洗凈血水，濾紙吸干，用剪刀剪為碎塊放入小容量玻璃勻漿器內(nèi)。加入1.0 mL冰預(yù)冷的Lysis Buffer，0℃冰浴上下研磨組織20次;

b. 培養(yǎng)細(xì)胞勻漿：消化細(xì)胞，PBS洗滌，800g離心5~10 min收集細(xì)胞，計(jì)數(shù)。每次提取需要5×107個(gè)細(xì)胞，加入1.0 mL冰預(yù)冷的Lysis Buffer重懸細(xì)胞，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到小容量玻璃勻漿器內(nèi)，0℃冰浴研磨30~40次。

2. 將組織或細(xì)胞勻漿物轉(zhuǎn)移到離心管，4℃，1000g 離心5 min。

3. 取上清，轉(zhuǎn)移至新的離心管中，4℃，1000g再次離心5 min。

4. 取上清，轉(zhuǎn)移至新的離心管中，4℃， 12,000 g 離心10 min。離心后的上清含胞漿成分，可從中提取胞漿蛋白。將上清轉(zhuǎn)移到新離心管，線粒體沉淀在管底。

5. 往線粒體沉淀中加入0.5 mL Wash Buffer重懸線粒體沉淀，4℃，1000 g 離心5 min。

6. 取上清，轉(zhuǎn)移至新的離心管中，4℃， 12,000 g 離心10 min。棄上清，高純度的線粒體沉淀在管底。

7. 用50 -100μL Store Buffer 或合適的反應(yīng)緩沖液重懸線粒體沉淀，立即使用或-70℃保存。

注意事項(xiàng)：

1. 為保證獲得完整的線粒體，務(wù)必做到：第一，全程低溫操作;第二，快速;第三，在不破壞亞細(xì)胞器的情況下破碎細(xì)胞，這是制備線粒體的最關(guān)鍵環(huán)節(jié)。與組織塊相比，培養(yǎng)細(xì)胞特別是貼壁培養(yǎng)細(xì)胞在用玻璃勻漿器勻漿時(shí)較難破壁，因而要選用小容量玻璃勻漿器、間隙嚴(yán)密的研杵上下研磨培養(yǎng)細(xì)胞。

2. 以離心力g計(jì)算正確的離心速度，不同的離心機(jī)可據(jù)此精確計(jì)算離心速度。3. 進(jìn)行Western Blot和2D-膠電泳，可直接加入上樣緩沖液裂解線粒體。轉(zhuǎn)速與離心力換算：G＝1.11×(10-5)×R×[rpm]２ G為離心力，一般以ｇ(重力加速度)的倍數(shù)來(lái)表示;[rpm]２即：轉(zhuǎn)速的平方;R為半徑，單位為厘米。

儲(chǔ)存條件：-20℃

線粒體提取試劑盒細(xì)胞生物學(xué)研究有以下幾個(gè)方面。

細(xì)胞生物學(xué)的研究?jī)?nèi)容十分廣泛,主要包括。
①細(xì)胞核、染色體以及基因表達(dá)的研究。
②生物膜與細(xì)胞器的研究。
③細(xì)胞骨架體系的研究。
④細(xì)胞增殖及其調(diào)控。
⑤細(xì)胞分化及其調(diào)控。
⑥細(xì)胞的衰老與編程性死亡(凋亡)。
⑦細(xì)胞的起源與進(jìn)化。
⑧細(xì)胞工程。

原創(chuàng)作者：上海莼試生物技術(shù)有限公司

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