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在機(jī)體內(nèi)部隨時(shí)都在發(fā)生著細(xì)胞的死亡。傳統(tǒng)上用顯微鏡來(lái)觀察細(xì)胞的死亡，其特征為核染色質(zhì)的濃縮及碎片的形成。但是這種現(xiàn)象出現(xiàn)的很晚，時(shí)間也很短暫。凋亡的特征是內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶被激活，細(xì)胞自身的染色質(zhì)或DNA 被切割，出現(xiàn)單鏈或雙鏈缺口，并產(chǎn)生與 DNA 斷點(diǎn)數(shù)目相同的3’-OH 末端。末端脫氧核糖核酸轉(zhuǎn)移酶(Terminal deoxynucleotidyl Transferase)可以將地高辛標(biāo)記的dUTP(DIG-dUTP)標(biāo)記至 3’-OH 末端，DIG-dUTP 結(jié)合在 DNA 斷點(diǎn)部位，可以通過生物標(biāo)記的抗地高辛抗體(Anti-DIG-Biotin)反應(yīng)后，再結(jié)合熒光素 FITC或者過氧化物酶 POD 標(biāo)記的鏈酶親和素(SABC-FITC/SABC-POD)。FITC 在 490-495nm 激化，在 520-530nm 發(fā)射熒光，在熒光顯微鏡下呈明亮黃綠色。POD的在加入顯色底物 DAB 顯色后，凋亡的細(xì)胞核呈棕黃色。用戶根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要，在不同切片上用兩套不同顯示系統(tǒng)觀察。

試劑盒內(nèi)容：

1．標(biāo)記緩沖液(Labeling Buffer)1ml

2．末端脫氧核糖核酸轉(zhuǎn)移酶(TdT,×20)20μl

3．DIG-dUTP(×20)20μl

4．封閉液(Blocking Reagent)4ml

5．生物素化抗地高辛抗體(× 100)20μl

6．SABC-FITC(× 100)20μl

7．SABC-POD(× 100)20μl

8．Proteinase K(×200)50μl

9．抗體稀釋液 4ml

10．未染色陽(yáng)性對(duì)照片 2 張。

用戶自備試劑：

1．多聚賴氨酸或APES。

2．0.01M TBS,PH7.5(配法:1L 雙蒸餾水中加入8.5克氯化鈉,1.2克 Tris和0.45—0.5ml純乙酸。)

3．水溶性封片劑。

操作步驟：

1．樣品處理

(1)玻片預(yù)先用多聚賴氨酸或APES 進(jìn)行處理。

(2)細(xì)胞涂片和冰凍切片：最重要的是及時(shí)固定。用 4%多聚甲醛/0.01M PBS(PH7.0---7.6)室溫下固定 30—60分鐘。0.01M PBS洗2分鐘×2次。蒸餾水洗滌 2分鐘×2次。

(3)組織：有條件時(shí)應(yīng)及時(shí)固定。常規(guī) 4%多聚甲醛/0.01M PBS(PH7.0---7.6)或10%中性緩沖福爾馬林固定4小時(shí)以上，石蠟包埋。切片常規(guī)脫蠟入水(脫蠟務(wù)必干凈)。

2．標(biāo)本片加 0.01M TBS 1:200 新鮮稀釋 Proteinase K 37℃消化 1—15分鐘,0.01M TBS洗2分鐘×3次。(細(xì)胞涂片和冰凍切片一般不消化或消化 10—60 秒鐘。新鮮石蠟切片消化 5-10分鐘。陳舊石蠟切片消化 10-15分鐘)。

3．標(biāo)本片加標(biāo)記緩沖液(Labeling Buffer)20μl/片,以保持切片濕潤(rùn)。按每張切片取 TdT和DIG-d-UTP 各1μl，加入18μl標(biāo)記緩沖液中，混勻。甩去切片上多余液體后加標(biāo)記液，20μl/片。置樣品于濕盒中，37℃標(biāo)記2小時(shí)。

4．0.01M TBS洗2分鐘×3次。

5．加封閉液 50μl/片，室溫30分鐘，甩掉封閉液，不洗。

6．用抗體稀釋液 1：100 稀釋生物素化抗地高辛抗體：(取 1ml 抗體稀釋液加生物素化抗地高辛抗體10μl)，混勻后 50μl/片加至標(biāo)本片上。置樣品于濕盒中，37℃反應(yīng)30分鐘。0.01M TBS洗2分鐘×3次。

7．用抗體稀釋液 1：100 稀釋 SABC-FITC/(SABC-POD)：取 1ml 抗體稀釋液加 SABC-FITC/(SABC-POD 10μl，混勻后 50μl/片加至切片。37℃反應(yīng)30分鐘。0.01M TBS洗5分鐘×4次。

8．加 SABC-FITC的在熒光顯微鏡下用藍(lán)色光激發(fā)觀察。

9．加 SABC-POD的，可選用 DAB 顯色：取 1ml 蒸餾水，分別加入 DAB 試劑盒中 A，B，C 試劑各一滴，混勻后加至標(biāo)本片上，顯色 10-30分鐘左右。水洗。

10．蘇木素輕度復(fù)染。0.01M TBS洗，蒸餾水洗。水溶性封片劑封片。

細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒IV(FITC+POD) 細(xì)胞生物學(xué)研究有以下幾個(gè)方面。

細(xì)胞生物學(xué)的研究?jī)?nèi)容十分廣泛,主要包括。
①細(xì)胞核、染色體以及基因表達(dá)的研究。
②生物膜與細(xì)胞器的研究。
③細(xì)胞骨架體系的研究。
④細(xì)胞增殖及其調(diào)控。
⑤細(xì)胞分化及其調(diào)控。
⑥細(xì)胞的衰老與編程性死亡(凋亡)。
⑦細(xì)胞的起源與進(jìn)化。
⑧細(xì)胞工程。

原創(chuàng)作者：上海莼試生物技術(shù)有限公司

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