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其檢測原理為：在正常的活細胞中，磷脂酰絲氨酸（phosphotidylserine，PS）位于細胞膜的內(nèi)側(cè)，但在早期凋亡的細胞中，PS 從細胞膜的內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細胞膜的表面，暴露在細胞外環(huán)境中。Annexin-Ⅴ（膜聯(lián)蛋白-V）是一種分子量為35-36KD的Ca2+ 依賴性磷脂結(jié)合蛋白，能與PS高親和力結(jié)合。可通過細胞外側(cè)暴露的磷脂酰絲氨酸與凋亡早期細胞的胞膜結(jié)合。

另外，本試劑盒中還提供了碘化丙啶（Propidium Iodide，PI）用來區(qū)分存活的早期細胞和壞死或晚期凋亡細胞。PI是一種核酸染料，它不能透過正常細胞或早期凋亡細胞的完整的細胞膜，但可以透過凋亡晚期和壞死細胞的細胞膜而使細胞核染紅。因此，將Annexin V與PI聯(lián)合使用時，PI 則被排除在活細胞（Annexin V-/PI-）和早期凋亡細胞（Annexin V+/PI-）之外，而晚期凋亡細胞和壞死細胞同時被FITC 和PI 結(jié)合染色呈現(xiàn)雙陽性（Annexin V+/PI+）。

注意事項

1) 由于細胞凋亡是一個快速的過程，建議樣品在染色后1小時之內(nèi)進行分析。

2) 對于貼壁細胞，消化是一個關鍵步驟。貼壁細胞誘導細胞凋亡時如有漂浮細胞，需收集漂浮細胞和貼壁細胞后合并染色。處理貼壁細胞時要小心操作，盡量避免人為的損傷細胞。胰酶消化時間過短，細胞需要用力吹打才能脫落，容易造成細胞膜的損傷，PI攝入過多；消化時間過長，細胞膜同樣易造成損傷，甚至會影響細胞膜上磷脂酰絲氨酸與Annexin V-FITC的結(jié)合。消化時將胰酶鋪滿孔板底后，輕搖時胰酶與細胞充分接觸，然后倒掉大部分胰酶，利用剩余的少量胰酶再消化一段時間，待細胞間空隙增大，瓶底呈花斑狀即可終止。在消化液中盡量不用EDTA，EDTA會影響Annexin V與PS的結(jié)合。

3) 實驗中如需要固定細胞，比如在檢測凋亡的同時檢測細胞周期，只能選用Annexin V-FITC，而不能選用Annexin V-EGFP，因為在固定過程中EGFP會變性導致喪失激發(fā)熒光的能力。固定前需要先將細胞與Annexin V-FITC進行孵育，并用binding buffer洗掉未結(jié)合的Annexin V-FITC。因為固定過程中細胞通透性增加會產(chǎn)生細胞碎片，可以和Annexin V結(jié)合，對結(jié)果產(chǎn)生干擾。

4) 如果樣品來源于血液，請務必除去血液中的血小板。因為血小板含有PS，能與Annexin V結(jié)合，從而干擾實驗結(jié)果。可以使用含有EDTA的緩沖劑并在200 g離心洗去血小板。

5) 試劑在開蓋前請短暫離心，將蓋內(nèi)壁上的液體甩至管底，避免開蓋時液體灑落。

6) Annexin V-FITC和PI是光敏物質(zhì)，在操作時請注意避光。

儲存條件：4℃，有效期一年。

細胞凋亡檢測試劑盒(Annexin V-FITC/PI)細胞生物學研究有以下幾個方面。

細胞生物學的研究內(nèi)容十分廣泛,主要包括。
①細胞核、染色體以及基因表達的研究。
②生物膜與細胞器的研究。
③細胞骨架體系的研究。
④細胞增殖及其調(diào)控。
⑤細胞分化及其調(diào)控。
⑥細胞的衰老與編程性死亡(凋亡)。
⑦細胞的起源與進化。
⑧細胞工程。

原創(chuàng)作者：上海莼試生物技術有限公司

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