保存條件：-20℃冰凍保存。
保存期：一年
工作原理：
在機體內部隨時都在發生著細胞的死亡。傳統上用顯微鏡來觀察細胞的死亡，其特征為核染色質的濃縮及碎片的形成。但是這種現象出現的很晚，時間也很短暫。凋亡的特征是內源性核酸內切酶被激活，細胞自身的染色質或DNA 被切割，出現單鏈或雙鏈缺口，并產生與 DNA 斷點數目相同的3’-OH 末端。末端脫氧核糖核酸轉移酶(Terminal deoxynucleotidyl Transferase)可以將地高辛標記的dUTP(DIG-dUTP)標記至 3’-OH 末端，DIG-dUTP 結合在 DNA 斷點部位，可以通過生物標記的抗地高辛抗體(Anti-DIG-Biotin)反應后，再結合熒光素 FITC或者過氧化物酶 POD 標記的鏈酶親和素(SABC-FITC/SABC-POD)。FITC 在 490-495nm 激化，在 520-530nm 發射熒光，在熒光顯微鏡下呈明亮黃綠色。POD的在加入顯色底物 DAB 顯色后，凋亡的細胞核呈棕黃色。用戶根據實驗需要，在不同切片上用兩套不同顯示系統觀察。
試劑盒內容：
1．標記緩沖液(Labeling Buffer)1ml
2．末端脫氧核糖核酸轉移酶(TdT,×20)20μl
3．DIG-dUTP(×20)20μl
4．封閉液(Blocking Reagent)4ml
5．生物素化抗地高辛抗體(× 100)20μl
6．SABC-FITC(× 100)20μl
7．SABC-POD(× 100)20μl
8．Proteinase K(×200)50μl
9．抗體稀釋液 4ml
10．未染色陽性對照片 2 張。
用戶自備試劑：
1．多聚賴氨酸或APES。
2．0.01M TBS,PH7.5(配法:1L 雙蒸餾水中加入8.5克氯化鈉,1.2克 Tris和0.45—0.5ml純乙酸。)
3．水溶性封片劑。
操作步驟：
1．樣品處理
(1)玻片預先用多聚賴氨酸或APES 進行處理。
(2)細胞涂片和冰凍切片：最重要的是及時固定。用 4%多聚甲醛/0.01M PBS(PH7.0---7.6)室溫下固定 30—60分鐘。0.01M PBS洗2分鐘×2次。蒸餾水洗滌 2分鐘×2次。
(3)組織：有條件時應及時固定。常規 4%多聚甲醛/0.01M PBS(PH7.0---7.6)或10%中性緩沖福爾馬林固定4小時以上，石蠟包埋。切片常規脫蠟入水(脫蠟務必干凈)。
2．標本片加 0.01M TBS 1:200 新鮮稀釋 Proteinase K 37℃消化 1—15分鐘,0.01M TBS洗2分鐘×3次。(細胞涂片和冰凍切片一般不消化或消化 10—60 秒鐘。新鮮石蠟切片消化 5-10分鐘。陳舊石蠟切片消化 10-15分鐘)。
3．標本片加標記緩沖液(Labeling Buffer)20μl/片,以保持切片濕潤。按每張切片取 TdT和DIG-d-UTP 各1μl，加入18μl標記緩沖液中，混勻。甩去切片上多余液體后加標記液，20μl/片。置樣品于濕盒中，37℃標記2小時。
4．0.01M TBS洗2分鐘×3次。
5．加封閉液 50μl/片，室溫30分鐘，甩掉封閉液，不洗。
6．用抗體稀釋液 1：100 稀釋生物素化抗地高辛抗體：(取 1ml 抗體稀釋液加生物素化抗地高辛抗體10μl)，混勻后 50μl/片加至標本片上。置樣品于濕盒中，37℃反應30分鐘。0.01M TBS洗2分鐘×3次。
7．用抗體稀釋液 1：100 稀釋 SABC-FITC/(SABC-POD)：取 1ml 抗體稀釋液加 SABC-FITC/(SABC-POD 10μl，混勻后 50μl/片加至切片。37℃反應30分鐘。0.01M TBS洗5分鐘×4次。
8．加 SABC-FITC的在熒光顯微鏡下用藍色光激發觀察。
9．加 SABC-POD的，可選用 DAB 顯色：取 1ml 蒸餾水，分別加入 DAB 試劑盒中 A，B，C 試劑各一滴，混勻后加至標本片上，顯色 10-30分鐘左右。水洗。
10．蘇木素輕度復染。0.01M TBS洗，蒸餾水洗。水溶性封片劑封片。
結果判定：
熒光顯微鏡下：細胞核中有黃綠色顆粒者為陽性細胞，即凋亡的細胞。
普通顯微鏡下：細胞核中有棕黃色顆粒者為陽性細胞，即凋亡的細胞。
注意事項：
1.試劑盒嚴格-20℃存放。
2.初用時如試管底部無可見的試劑，在離心機離心 5分鐘，使試劑沉至管底。
3.檢測過程中切勿使樣品干涸。
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