保存條件：-20℃冰凍保存一年。
工作原理：
在機體內部隨時都在發生著細胞的死亡。傳統上用顯微鏡來觀察細胞的死亡，其特征為核染色質的濃縮及碎片的形成。但是這種現象出現的很晚，時間也很短暫。凋亡的特征是內 源性核酸內切酶被激活，細胞自身的染色質或DNA 被切割，出現單鏈或雙鏈缺口，并產生 與 DNA 斷點數目相同的3’-OH 末端。末端脫氧核糖核酸轉移酶(Terminal deoxynucleotidyl Transferase)可以將地高辛標記的dUTP(DIG-dUTP)標記至 3’-OH 末端，DIG-dUTP 結 合在 DNA 斷點部位，可以通過生物標記的抗地高辛抗體(Anti-DIG-Biotin)反應后，再結合 鏈酶親和素-熒光素 CY3(SABC-CY3)。Cy3 在 554nm 激化，在 568-574nm 發射熒光，呈鮮紅色，從而可以在顯微鏡下觀察到著色的凋亡細胞。
試劑盒內容：
1．標記緩沖液(Labeling Buffer)1ml
2．末端脫氧核糖核酸轉移酶(TdT,×20)20μl
3．DIG-dUTP(×20)20μl
4．封閉液(Blocking Reagent)4ml
5．生物素化抗地高辛抗體(× 100)20μl
6．SABC-CY3(× 100)20μl
7．Proteinase K(×200)50μl
8 抗體稀釋液 4ml
陽性對照片 2 張
用戶自備試劑
1．多聚賴氨酸或APES。
2．0.01M TBS,PH7.5(配法:1L 雙蒸餾水中加入 8.5 克氯化鈉,1.2 克 Tris和0.45—0.5ml 純 乙酸。)
3．DAPI 染色液
4．水溶性封片劑或抗熒光衰減封片劑。
操作步驟
1．樣品處理
(1)玻片預先用多聚賴氨酸或APES 進行處理。
(2)細胞涂片和冰凍切片：最重要的是及時固定。用4%多聚甲醛/0.01MPBS(PH7.0---7.6)室溫下固定30—60分鐘。0.01M PBS洗2分鐘×2次。蒸餾水洗滌2分鐘×2次。
(3)組織：有條件時應及時固定。常規 4%多聚甲醛/0.01M PBS(PH7.0---7.6)或10%中性緩沖 福爾馬林固定 4 小時以上，石蠟包埋。切片常規脫蠟入水(脫蠟務必干凈)。
2．標本片加 0.01M TBS 1:200 新鮮稀釋 Proteinase K 37℃消化 1—15分鐘,0.01MTBS洗2分鐘×3次。(細胞涂片和冰凍切片一般不消化或消化 10—60 秒鐘。新鮮石蠟切片消化 5-10分鐘。陳舊石蠟切片消化10-15分鐘)。
3．標本片加標記緩沖液(Labeling Buffer)20μl/片,以保持切片濕潤。按每張切片取TdT和 DIG-d-UTP 各 1μl ，加入18μl標記緩沖液中，混勻。甩去切片上多余液體后加 標記液，20μl/片。置樣品于濕盒中，37℃標記2小時。
4．0.01M TBS洗2分鐘×3次。
5．加封閉液 50μl/片，室溫 30分鐘，甩掉封閉液，不洗。
6．用抗體稀釋液 1：100 稀釋生物素化抗地高辛抗體：(取 1ml 抗體稀釋液加生物素化抗地 高辛抗體 10μl)，混勻后 50μl/片加至標本片上。置樣品于濕盒中，37℃反應30分鐘。0.01M TBS洗2分鐘×3次。
7．用抗體稀釋液 1：100 稀釋 SABC：取 1ml 抗體稀釋液加 SABC 10μl ，混勻后50μl/ 片加至切片。37℃反應 30分鐘。0.01M TBS洗5分鐘×4次。
8．必要時可用 DAPI 染色液(貨號 AR1176，AR1177)輕度復染，蒸餾水洗。抗熒光衰減封 片劑封片(可用甘油代替)。熒光顯微鏡觀察。
結果判定：細胞核中有鮮紅色顆粒者為陽性細胞，即凋亡的細胞。
注意事項：
1．試劑盒嚴格-20℃存放。
2．初用時如試管底部無可見的試劑，在離心機離心 5分鐘，使試劑沉至管底。
3．檢測過程中切勿使樣品干涸。
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021-59541103 021-60443211
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