中文名稱：Ad-mCherry-GFP-LC3B
英文名稱：adenovirus expressing mCherry-GFP-LC3B fusion protein
產品規格：1ml|10×1ml
發貨周期：1～3天
本品是一種可以表達mCherry-GFP-LC3B融合蛋白的腺病毒，可以用于感染細胞或組織后進行細胞自噬的檢測。
LC3是酵母自噬關鍵蛋白ATG8在哺乳動物中的同源蛋白。LC3最初被分析鑒定為microtubule-associated protein 1 light chain 3。LC3蛋白家族包括LC3A、B、C和GABARAP等亞家族，其中對于LC3B的研究最為廣泛。到目前為止，LC3B被認為是細胞自噬信號通路最為關鍵的標志性蛋白。LC3B是一個具有125個氨基酸殘基的蛋白，在蛋白合成后，被Atg4所酶切而失去了C端的22個氨基酸蛋白，從而暴露出C端的甘氨酸，人們把它命名為胞質形式的LC3B I。在細胞自噬的過程中，其C端暴露的甘氨酸經過一個類似泛素化的過程，以ATG7為E1樣激活酶， 以ATG3為E2樣連接酶，以Atg12-Atg5-Atg16復合物為E3樣連接酶，在C端甘氨酸上共價連接上磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine,PE)而成為LC3B-PE即LC3B II。與胞質定位的LC3B I不同，LC3B II定位于自噬體的內膜和外膜上。在自噬體與溶酶體融合后，自噬體外膜上的LC3B II被Atg4所酶切，而自噬體內膜上的LC3B II則被溶酶體內的蛋白酶所降解。盡管LC3B II比LC3B I的分子量要大，但由于其極強的疏水性，在SDS-PAGE電泳時，LC3B II比LC3B I遷移得更快，其表觀分子量分別為14kD和16kD。在用GFP-LC3B腺病毒感染細胞后，在非自噬的情況下，熒光顯微鏡下GFP-LC3B以彌散的形式存在于細胞質中；而在自噬的情況下，熒光顯微鏡下GFP-LC3B則聚集在自噬體膜上，以斑點的形式表現出來。
自噬是一種在進化上高度保守的通過溶酶體吞噬并降解部分自身組分的細胞內分解代謝途徑。自噬與多種生理功能有關，在饑餓等不利的環境條件下， 細胞通過自噬降解多余或異常的細胞內組分，為細胞的生存提供能量及原材料，促進生物體的生長發育、細胞分化及對環境變化產生應答。自噬異常與多種病理過程如腫瘤、神經退行性疾病、代謝疾病、病原體感染等都有密切關系。由于細胞自噬在生理和病理過程中都有重要作用，自噬已經成為細胞生物學領域的一個新的研究熱點。
Ad-mCherry-GFP-LC3B是重組腺病毒，感染后能夠在靶細胞中有效表達紅色熒光蛋白mCherry、綠色熒光蛋白(GFP)和LC3B的融合蛋白，呈現明亮的紅色和綠色熒光，可以用于細胞自噬的檢測。
自噬小體在與溶酶體融合過程中，溶酶體內的酸性環境會導致GFP熒光淬滅，這為追蹤GFP-LC3B的細胞定位增加了難度。mCherry是一種來自于蘑菇珊瑚(mushroom coral)的單體紅色熒光蛋白，當其與GFP進行LC3B的共同標記時，在GFP被溶酶體酸性環境所淬滅的情況下，可以發出紅色熒光的mCherry因為其卓越的穩定性而被保留。因此，通過融合表達mCherry-GFP-LC3B蛋白，可以非常有效地追蹤自噬過程。在用Ad-mCherry-GFP-LC3B腺病毒感染細胞后，在非自噬的情況下，熒光顯微鏡下mCherry-GFP-LC3B以彌散的黃色熒光(mCherry和GFP的綜合效果)形式存在于細胞質中；而在自噬的情況下，熒光顯微鏡下mCherry-GFP-LC3B則聚集在自噬體膜上，以黃色斑點的形式表現出來(LC3B dot or punctae)；當自噬體與溶酶體融合后，因GFP熒光的部分淬滅而以紅色斑點的形式表現出來。
腺病毒感染細胞后為瞬時表達，通常不會與基因組DNA重組，不能用于篩選穩定細胞株。本產品感染體內外細胞后，有效表達時間通常不少于7天，不同細胞和組織的有效表達時間有所不同。感染10-14天后融合蛋白的表達很可能會大大減弱。
d-mCherry-GFP-LC3B采用了成熟的E1缺陷型重組腺病毒載體系統，感染普通的細胞后不能進行擴增和重組，從而可以有效降低本產品在活體生物中的風險。
本產品可以在表達E1的HEK293A、HEK293等適當細胞中擴增。
本產品的滴度≥1×108 pfu/ml，使用時可以按照108pfu/ml進行計算。如果按照20 MOI感染6孔板的細胞，每孔50萬細胞計算，共可以感染10個孔；如果按照20 MOI感染24孔板的細胞，每孔10萬細胞計算，共可以感染50個孔。如果MOI值提高，則相應可以感染的孔數會減少；如果MOI值降低，則相應可以感染的孔數會增加。
注意事項：
1. 反復凍融會降低病毒滴度，如有必要請在收到本產品后分裝保存。病毒融解后，如果在一周內使用，可以放置于4℃。如果-80℃保存時間超過一年，可能會導致滴度下降，此時建議重新測定病毒滴度。
2. 腺病毒感染需要細胞表面的CAR受體，請確認擬使用的細胞或組織可以被腺病毒感染。
3. 本產品使用前請仔細閱讀附錄1《腺病毒使用安全規范》。本產品生物安全等級為Biosafety Level 1 (BSL-1)，沒有確鑿證據顯示會導致健康成人產生疾病，可以按照常規的微生物實驗操作要求進行操作。
儲存條件：-20℃，有效期1～2個月。
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