細胞衰老是隨著時間的推移,細胞增殖能力和生理功能逐漸下降的變化過程,是個體衰老的重要基礎。體外培養二倍體細胞是目前用于疫苗生產最安全的細胞基質,其使用代次限制在生命周期的三分之二以內。目前對不同代次二倍體細胞在細胞、蛋白及分子等不同層次的變化尚不清楚,缺乏評價二倍體細胞衰老程度的有效手段。研究
人胚肺二倍體細胞衰老特征變化,對生產用細胞基質安全評價以及衰老相關疾病研究具有重要意義。
方法：1.將Walvax-2細胞分20代、25代、30代、35代至45代、50代和55代共16個代次,其中35代到45代之間均隔1代；2倒置顯微鏡下觀察不同代次Walvax-2細胞顯微結構及生長情況；3.透射電鏡下觀察不同代次Walvax-2細胞超微結構；4.以
細胞衰老β-半乳糖苷酶染色法檢測不同代次Walvax-2細胞β-半乳糖苷酶表達；5.以TRAP-PCR方法檢測不同代次Walvax-2細胞端粒酶活性；6.繪制作生長曲線,觀察不同代次Walvax-2細胞生長增殖能力；7.通過流式細胞儀檢測不同代次Walvax-2細胞周期時相和細胞凋亡；8.Western印跡法檢測不同代次Walvax-2細胞的P16基因和BMI-1基因的蛋白表達。
結果：1.倒置顯微鏡下：P20到P45生長狀態良好且生長迅速,細胞為典型長梭狀,為致密單層,緊密排列,呈編織狀走行。胞內顆粒少,無空泡,膜清晰,符合二倍體成纖維細胞特性。P50細胞排列不規則,形狀偏扁,體積縮小、顏色加深,邊界不清,形態不規則,鏡下可見少許圓縮細胞。P55貼壁生長的細胞散亂,細胞間空隙多,距離遠,細胞間的接觸消失,細胞圓縮數大量增加,
細胞內部結構不清楚,成批的細胞出現脫落,離壁飄起的現象。細胞可傳58代,隨細胞代次的增加,可見顏色逐漸加深,色素積累。2.透射電子顯微鏡觀察到：P20到P43細胞體積均正常且骨架結構明顯,細胞膜微絨毛均勻分布,核糖體豐富,細胞核完整,核膜光滑,具有較高的核質比。P44開始出現衰老現象,凋亡小體出現,內質網膜腔膨脹擴大,核糖體數量減少,細胞質色素積聚加深,有空泡形成,細胞中出現自噬體,細胞核形狀不規則,核膜不同程度內折,核仁變小,內容物增多。P50和P55細胞衰老更加明顯,大量細胞變形,體積增大,細胞膜完整性遭到破壞,細胞質色素積聚加深,微絲和微管崩解,可見大量空泡形成,內質網與線粒體崩解；自噬體數量增加,細胞核模糊不清。3.β-半乳糖苷酶檢測顯示：與初始代次年輕細胞P20(陽性細胞率13.42%)相比,衰老代次P55的陽性細胞率(37.72%)增強,Walvax-2
人胚肺二倍體細胞趨向老化過程中β-半乳糖苷酶的陽性染色率逐代遞增。β-半乳糖苷酶的陽性染色率和細胞代齡之間呈顯著相關(P0.05)。4.端粒酶的檢測結果分析顯示：P20至P55端粒酶活性呈整體減少趨勢,Walvax-2細胞端粒酶活性與代齡無顯著性相關(P0.05)。5生長曲線分析顯示：P50相比P20的生長速度明顯減慢,P20的細胞活力明顯強于P40(P0.05)和P50(P0.05),P30的細胞活力明顯強于P40(P0.05)和P50(P0.05),P40的細胞活力明顯強于P50(P0.05)。6流式細胞儀檢測結果顯示：不同代次G0/G1期百分比無變化,G2/M期同S期百分比隨細胞代齡增長而降低,P55的S期細胞基本消失。檢測到的細胞碎片隨細胞代齡增長而增加,P55的細胞碎片達到36.83%。S期所占百分比與細胞代齡間的增長顯著負相關(P0.05),G2/M期所占百分比與細胞代齡間的增長顯著負相關(P0.05),細胞碎片所占百分比與細胞代齡間的增長顯著正相關(P0.05)。7. Western印跡法檢測結果顯示：不同代次Walvax-2細胞的p16蛋白和BMI-1蛋白均未檢測到表達。
結論：1、細胞形態學變化,β-半乳糖苷酶染色陽性率,流式細胞儀檢測細胞周期中的S期、G2/M期和細胞碎片,細胞生長曲線均與Walvax-2細胞代齡增長顯著相關。可選擇作為Walvax-2細胞衰老程度評價的生物學指標。2、端粒酶活性與Walvax-2細胞代齡間的增長整體呈負相關趨勢,但無統計學意義。是否適合作為Walvax-2細胞衰老評價生物學指標有待進一步研究。3、Walvax-2細胞中p16蛋白和BMI-1蛋白均未檢測到表達,不適合作為Walvax-2細胞衰老評價生物學指標。
以
人胚肺二倍體細胞Walvax-2細胞為研究對象,在細胞顯微結構、超微結構、酶學變化、蛋白表達以及細胞生長等不同水平,通過檢測不同代次人胚肺二倍體細胞衰老相關標記物,篩選出能夠評價人胚肺二倍體細胞衰老程度的可靠生物學指標。
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