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公司新聞

蛋白樣品制備,一般裂解液包含幾個(gè)組分

閱讀：3650     發(fā)布時(shí)間：2019/5/14 9:36:21

       Western Blot 又稱為蛋白質(zhì)印跡，是分子生物學(xué)、生物化學(xué)和免疫遺傳學(xué)中常用的基于抗原抗體之間特異免疫反應(yīng)的一種定量或定性檢測(cè)蛋白的實(shí)驗(yàn)方法。

      其基本原理為：聚丙烯酰胺凝膠電泳將不同分子量的蛋白質(zhì)樣品分離，分離后的蛋白被轉(zhuǎn)移到固相支撐物（雜交膜）上，一抗特異性識(shí)別目標(biāo)蛋白，通過HRP、AP、生物素、地高辛或者熒光探針等標(biāo)記的二抗識(shí)別一抗，最終通過顯色、熒光或者化學(xué)發(fā)光等方法將目標(biāo)蛋白可視化，從而對(duì)目標(biāo)蛋白進(jìn)行定性和定量分析。
良好的開始是成功的一半，充分裂解并保存良好的優(yōu)質(zhì)的蛋白樣品對(duì) Western Blot 實(shí)驗(yàn)至關(guān)重要。下面我們將從蛋白樣品制備的方法和試劑選擇上給大家一些建議。

 

裂解液的選擇
蛋白樣品制備，首先要選擇合適的裂解液。一般裂解液包含以下幾個(gè)組分:

1. 緩沖系統(tǒng)：裂解液pH過高或過低都可能使蛋白質(zhì)變性析出或水解，因此通常采用近似生理pH的buffer來作緩沖體系。Tris-HCl緩沖液因其緩沖能力強(qiáng)，不容易與其它離子形成不溶物，且與整個(gè)電泳系統(tǒng)兼容性好，因此是裂解的首選緩沖液。

2. 鹽離子濃度：通常大家習(xí)慣以生理鹽濃度作為裂解液的鹽離子濃度。在提胞漿蛋白等易溶組分時(shí)，也有通過低鹽而實(shí)現(xiàn)低滲，從而使細(xì)胞脹破以實(shí)現(xiàn)質(zhì)膜分離的，這種情況下一般使用不超過50mM的NaCl。當(dāng)鹽離子濃度過高時(shí)，部分蛋白可能會(huì)因鹽析而出現(xiàn)沉淀， 此外過高的離子濃度會(huì)導(dǎo)致泳道內(nèi)局部電流過大，容易跑出笑臉狀條帶。實(shí)際過程中即使有少數(shù)蛋白可能需要高鹽提取的，也會(huì)借助透析等方法除去可能產(chǎn)生干擾的鹽分，最終NaCl濃度一般不能高于500mM。

3. 變性劑：常用的變性劑有兩類，一類是以尿素或硫脲為代表的變性劑，另一類則是各種表面活性劑（俗稱去垢劑）。變性劑的作用主要是為了使蛋白變性溶解，在膜蛋白和包涵體蛋白提取時(shí)經(jīng)常會(huì)加入尿素助溶。

4. 蛋白酶、去修飾酶抑制劑：組織或細(xì)胞內(nèi)通常含有大量的蛋白酶和去修飾酶，由于細(xì)胞在裂解過程中會(huì)釋放出多種內(nèi)源性的蛋白酶、磷酸酶、去乙酰化酶等，容易導(dǎo)致目標(biāo)蛋白降解或去修飾，從而影響后續(xù)的蛋白檢測(cè)。所以在裂解時(shí)還需加入一些酶抑制劑。

常見的蛋白酶抑制劑有：PMSF、Aprotinin、Leupeptin、 Pepstatin，AEBSF-HCl等，其中PMSF對(duì)多種不同活性中心的蛋白酶都有極好的抑制作用而且效率高，因此基本是必加的試劑。

另外，做磷酸化蛋白的Western blot時(shí)，還需要加入磷酸酶抑制劑，避免磷酸化形式的蛋白發(fā)生去磷酸化。類似地，檢測(cè)乙酰化蛋白的時(shí)候還需要加入去乙酰化酶抑制劑。

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