抗體的酶標記方法及標記效果測定

1.標記方法 良好的酶結合物取決于兩個條件:即高效價的抗體和高活性的酶?？贵w的活性和純度對制備標記抗體至關重要,因為特異性免疫反應隨抗體活性和純度的增加而增強。在酶標記過程中,抗體的活性有所降低,故需要純度高、效價高及抗原親和力強的抗體球蛋白,最好使用親和層析提純的抗體,可提高敏感性,而且可稀釋使用,減少非特異性吸附。

酶與抗體交聯,常用戊二醛法和過碘酸鹽氧化法。郭春祥建立的HRP標記抗體的改良過碘酸鈉法簡單易行,標記效果好,特別適用于實驗室的小批量制備。其標記程序為:將5μg HRP溶于0.5ml蒸餾水中,加入新鮮配制的0.06 mol/L的過碘酸鈉(NaIO4)水溶液0.5ml,混勻置4℃冰箱30分鐘 , 取出加入0.16mol/L的乙二醇水溶液0.5ml,室溫放置30分鐘后加入含5(g純化抗體的水溶液1ml,混勻并裝透析袋,以0.05mol/L、pH9.5的碳酸鹽緩沖液于4℃冰箱中慢慢攪拌透析6小時(或過夜)使之結合,然后吸出,加硼氫化鈉(NaBH4)溶液( 5(g/ml)0.2ml,置4℃冰箱2小時,將上述結合物混合液加入等體積飽和硫酸銨溶液,置4℃冰箱30分鐘后離心,將所得沉淀物溶于少許0.02mol/L、pH7.4PBS中,并對之透析過夜(4℃),次日離心除去不溶物,即得到酶標抗體,用0.02mol/L、pH7.4PBS稀至5ml,進行測定后,冷凍干燥或低溫保存。

2.酶標抗體標記效果測定:測定內容包括酶和抗體活性、結合物中酶含量和IgG含量、酶與IgG摩爾比值以及結合率。

(1) 酶與抗體的活性 常用瓊脂擴散或免疫電泳法,使抗原與抗體形成沉淀線,經PBS漂洗1天,再以蒸餾水浸泡1小時,將瓊脂凝膠片浸于酶底物溶液中著色,如果出現應有的顏色反應,再用生理鹽水浸泡,顏色仍然不褪,表示結合物既有酶的活性,也有抗體活性。良好的結合物在顯色后,瓊擴滴度應在1:16以上。另一個測定方法是用系列稀釋的酶標抗體直接以ELISA(酶聯免疫吸附試驗,酶聯免疫試劑盒)方法進行方陣滴定,此法不僅可以測定標記效果,還可以確定酶標抗體的使用濃度。

(2) 結合物的定量測定 一般是對結合物中的酶和IgG進行定量測定。常用紫外分光光度計于403nm和280nm進行測定,然后按下列公式計算:

酶量(mg/ml)=OD403×0.42

IgG量(mg/ml)=(OD280-OD403×0.4)×0.94×0.62

對于過碘酸鈉氧化法制備的標記抗體量,按下列公式計算:

IgG量(mg/ml)=(OD280-OD403×0.34)×0.62

已知酶量和IgG量后,即可計算出標記抗體的摩爾(mol)比值。

HRP/IgG摩爾比值=HRP(mg/ml)/IgG(mg/ml)×4

結合物中酶總量=HRP(mg/ml)×結合物溶液量

結合物產率=結合物中酶總量/標記時加入的酶量×100%

用于ELISA(酶聯免疫吸附試驗,酶聯免疫試劑盒)的結合物的酶量為400(g/ml時效果一般,為500(g/ml時效果較好,達 1000(g/ml時效果最好。mol.比值由于結合物中含的IgG并不完全可靠,所以不能作為主要參數。一般認為mol.比值為0.7時效果一般,1.0時效果較好,1.5-2.0時最好。酶結合率為 7%時效果一般,為9%-10%較好,達30%以上時最好。(四) ELISA(酶聯免疫吸附試驗,酶聯免疫試劑盒)方法的基本類型、用途及操作程序

原創作者：上海莼試生物技術有限公司