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Elisa試劑盒常用方法與常見問題有哪些?
閱讀:962 發(fā)布時(shí)間:2019/1/14 13:49:57
Elisa試劑盒常用方法與常見問題有哪些?ELISA原理及類型ELISA是一種廣泛應(yīng)用在測(cè)定液體樣本中的蛋白、抗體、或激素的免疫分析技術(shù)。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)程序,通常是把蛋白、抗體、或激素等(即抗原)直接或是以捕捉抗體(capture Ab)固定在固相載體上,再加入一級(jí)檢測(cè)抗體(primarydetection Ab),形成一個(gè)抗原抗體的復(fù)合物。如果該抗體已經(jīng)用酶(enzyme)標(biāo)記了,即可用來直接測(cè)定抗原的量,若無,則可利用另一個(gè)酶標(biāo)記的二級(jí)抗體來測(cè)定抗原的量。測(cè)定抗原量的方法是加入該酶的底質(zhì)(substrate),作用后產(chǎn)生出現(xiàn)的顏色深淺和樣本中的抗原量呈正比的關(guān)系,依此原理計(jì)算出樣本中的抗原總量或濃度。1.直接法(direct ELISA)將抗原直接固定在固相載體上,加入酶標(biāo)記的一級(jí)抗體,即可測(cè)定抗原總量,此一級(jí)抗體的特異性非常重要。優(yōu)勢(shì):操作手續(xù)簡(jiǎn)短,因無須使用二抗可避免交互反應(yīng)。缺點(diǎn):試驗(yàn)中的一抗都得用酶標(biāo)記,但不是每種抗體都適合做標(biāo)記,費(fèi)用相對(duì)提高。2.間接法(indirect ELISA)此測(cè)定方法與直接法類似,差別在于一級(jí)抗體沒有酶標(biāo)記,改用酶標(biāo)記的二級(jí)抗體去辨識(shí)一級(jí)抗體來測(cè)定抗原量。優(yōu)勢(shì):二抗可以加強(qiáng)信號(hào),而且有多種選擇能做不同的測(cè)定分析。不加酶標(biāo)記的一級(jí)抗體則能保留它最多的免疫反應(yīng)性。缺點(diǎn):交互反應(yīng)發(fā)生的機(jī)率較高。3.雙抗體夾心法(sandwich ELISA)被檢測(cè)的抗原包被在兩個(gè)抗體之間,其中一個(gè)抗體將抗原固定于固相載體上,即捕捉抗體。另一個(gè)則是檢測(cè)抗體,此抗體可用酶標(biāo)記后直接測(cè)定抗原的量;或不標(biāo)記,再透過酶標(biāo)記的二級(jí)抗體來測(cè)定抗原的量。這兩種抗體必須小心選取,才可避免交互反應(yīng)或競(jìng)爭(zhēng)相同的抗原結(jié)合部位。優(yōu)勢(shì):高靈敏、高專一性,抗原無須事先純化。缺點(diǎn):抗原一定得擁有兩個(gè)以上的抗體結(jié)合部位。4.競(jìng)爭(zhēng)法(competitive ELISA)樣本里的抗原(自由抗原)和純化并固定在固相載體上的抗原(固定抗原)一起競(jìng)爭(zhēng)相同的抗體,當(dāng)樣品里的自由抗原越多,就可以結(jié)合越多的抗體,而固定抗原就只能結(jié)合到較少的抗體,反之亦然。經(jīng)清洗步驟,洗去自由抗原和抗體的復(fù)合物,只留下固定抗原和抗體的復(fù)合物,拿來與只有固定抗原的對(duì)照組結(jié)果相比較,根據(jù)呈色差異就可計(jì)算出樣品里的抗原含量。優(yōu)勢(shì):可適用比較不純的樣本,而且數(shù)據(jù)再現(xiàn)性很高。缺點(diǎn):整體的敏感性和專一性都較差。5.最新ELISA技術(shù)基于細(xì)胞法(cell-based ELISA):是一種新的定性蛋白檢測(cè)技術(shù),將細(xì)胞直接在微孔板里培養(yǎng),待檢測(cè)時(shí),不需抽提蛋白和裂解細(xì)胞,便可直接測(cè)量微孔板里蛋白經(jīng)刺激或抑制作用后的變化。優(yōu)勢(shì):無需裂解細(xì)胞,所以目標(biāo)蛋白損失最少,可測(cè)定完整細(xì)胞、黏附細(xì)胞、還有非粘附細(xì)胞。缺點(diǎn):不能測(cè)定抗原量。ELISA實(shí)驗(yàn)中可能影響結(jié)果的原因及解決方法樣品收集和保存用于ELISA測(cè)定最常用的臨床標(biāo)本是血清(漿)。要注意避免嚴(yán)重溶血,因?yàn)檠t蛋白中含有具有類似過氧化物活性的血紅素基團(tuán),在孵育時(shí)很容易吸附于固相,與HRP底物反應(yīng)產(chǎn)生假陽(yáng)性。樣品采集及血清分離中要注意避免細(xì)菌污染,一方面細(xì)菌分泌的酶可能對(duì)抗原抗體等蛋白產(chǎn)生分解作用,另一方面,細(xì)菌的內(nèi)源性酶如大腸桿菌的β-半乳糖苷酶會(huì)對(duì)相應(yīng)酶作標(biāo)記的測(cè)定方法產(chǎn)生非特異性干擾。樣品應(yīng)該要避免反復(fù)凍融。因反復(fù)凍融所產(chǎn)生的機(jī)械剪切力對(duì)標(biāo)本中的蛋白等分子產(chǎn)生破壞作用,從而引起假陰性結(jié)果。另外,樣品混勻時(shí),不要?jiǎng)×艺袷帲磸?fù)顛倒混勻即可。一般而言,如果在收集樣品的當(dāng)天進(jìn)行檢測(cè),可將樣品及時(shí)儲(chǔ)存在4℃?zhèn)溆茫欢鴮?duì)隔天再檢測(cè)的樣本,應(yīng)及時(shí)分裝后凍存在-20℃?zhèn)溆?,若要長(zhǎng)期保存樣品,最好將其置于-70℃凍存。
原創(chuàng)作者:上海莼試生物技術(shù)有限公司