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大腸桿菌TOP10化學感受態細胞

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  • 產品產地：國產
  • 包裝類型:盒裝
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  • 含量：0.1mL*10
  • 品牌名稱:莼試
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簡介內容：大腸桿菌TOP10化學感受態細胞現貨供應，價格實惠。

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標簽:大腸桿菌TOP10化學感受態細胞 0 1mL*10 

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大腸桿菌TOP10化學感受態細胞

E.coli TOP10 Chemical Competent Cell

0.1mL*10

CS-01F99199

本產品是采用大腸桿菌TOP10菌株經特殊工藝處理得到的感受態細胞，可用于DNA的化學轉化。該菌株是一種用于鋪制與培養質粒平板和粘粒平板的重級缺陷的抑制型株，其φ80lacZΔM15基因產物可與載體編碼的β-半乳糖苷酶氨基端實現α 互補，可用于藍白斑篩選。使用pUC19質粒檢測，轉化效率可達108。本感受態細胞具有鏈霉素抗性。

菌株的基因型：F-mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC)φ80 lacZΔM15ΔlacX74 recA1 araΔ139Δ(ara-leu)7697 galU galK rpsL(Strr)endA1 nupG。

儲存條件：干冰運輸、-80℃保存，有效期半年。

自備試劑：目的DNA、SOC或LB培養基等。

使用方法：

1. 取感受態細胞置于冰浴中。一次轉化感受態細胞的建議用量為50-100μl，可以根據實際情況分裝使用。

以下實驗以50μL感受態細胞為例。

2. 待感受態細胞融化后，向感受態細胞懸液中加入目的DNA(根據實際情況加入適量的DNA，通常100μl感受態細胞能夠被1 ng超螺旋質粒DNA所飽和)，用移液器輕輕吹打混勻，冰浴30分鐘。

3. 42℃熱擊45秒，迅速將離心管轉移到冰浴中，冰上靜置2-3分鐘。

4. 每個離心管中加入450μl 無菌的SOC或LB培養基(不含抗生素)，混勻后置于37℃搖床，150rpm 振蕩培養45分鐘使菌體復蘇。

5. 根據實驗需求，取適量已轉化的感受態細胞，加到含相應抗生素的SOC或LB 固體瓊脂培養基上，用無菌的涂布棒將細胞均勻涂開，將平板置于37℃直至液體被吸收，倒置培養，37℃培養12-16小時。

注意事項：

1. 涂布用量可根據具體實驗調整。若轉化的DNA總量較多，可取少量轉化產物涂布平板；若轉化的DNA總量較少，可取200-300μl轉化產物涂布平板。若預計的克隆數較少，可通過離心(4000rpm，2分鐘)后吸除部分培養液，懸浮菌體后將其涂布于平板中。

2. 新制備的固體培養基不易涂干，可將平板正置于37℃直至液體被吸收后再倒置培養。
3. 涂布剩余的菌液可置于4℃保存，如果次日的轉化菌落數過少，可以將剩下的菌液再涂布新培養基進行培養。
實驗步驟：
(1)實驗開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)
(2)取約0.8g菌絲體(液體培養獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養就更好說了),在液氮中迅速磨成精細粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預熱的RNA提取液,顛倒混勻  
(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次
(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)
(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)
(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)
(7)10,000rpm,4℃離心20min
(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀
(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)
(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上
(11)12,000rpm,4℃離心20 min
(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥
(13)加200ul的DEPC處理水溶解
(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計掃描檢測RNA的質量
(在抽提過程中,若蛋白質含量或其它的雜質還較多,可以增加抽提次數)
操作步驟:
1. 勻漿處理:a.組織 將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進行勻漿處理。樣品體積不應超過TRIzol體積10℅。
b.單層培養細胞 直接在培養板中加入TRIzol裂解細胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應根據培養板面積而定，不取決于細胞數。TRIzol加量不足可能導致提取的RNA有DNA污染。
c．細胞懸液 離心收集細胞，每5-10×106動物、植物、酵母細胞或1×107細菌細胞加入1ml TRIzol，反復吸打。加TRIzol之前不要洗滌細胞以免mRNA降解。一些酵母和細菌細胞需用勻漿儀處理。產品僅用于科研
2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復合物完全分離。
3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質，脂肪，多糖或胞外物質（肌肉，植物結節部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時，上層有大量油脂應去除。取澄清的勻漿液進行下一步操作。
5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。
6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機相，上層為無色水相和一個中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。
7. 把水相轉移到新管中，如要分離DNA和蛋白質可保留有機相，進一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。
8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側和管底出現膠狀沉淀。移去上清。

原創作者：上海莼試生物技術有限公司

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