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一氧化氮檢測探針

  • 產品貨號：CS-01F97033
  • 產品價格：電議
  • 產品產地：國產
  • 包裝類型:盒裝
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  • 庫存：100
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  • 含量：100T
  • 品牌名稱:莼試
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簡介內容：一氧化氮檢測探針現貨供應，價格實惠。

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標簽:一氧化氮檢測探針 100T 

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一氧化氮檢測探針

DAF-FM DA Solution (5mM in DMSO)

100T

CS-01F97033

本品為溶解于DMSO的淡黃色溶液，濃度為5mM。本品適用于檢測細胞內的一氧化氮水平，推薦工作濃度為1-10μM。如果收集細胞后再裝載探針，通常至少可以檢測100個樣品。

DAF-FM DA即4-Amino-5-Methylamino-2,7-Difluorofluorescein Diacetate，也稱DAF-FM Diacetate，是新一代用于一氧化氮（nitric oxide, NO）定量檢測的探針，其檢測原理為：DAF-FM DA可以穿過活細胞膜（cell-permeable），進入細胞后可以被胞漿內的酯酶催化形成不能穿過細胞膜的DAF-FM。DAF-FM本身僅有很弱的熒光，光量子約0.005，但在與NO反應后生成熒光素-苯駢三氮唑（benzotriazole），發烈綠色熒光，光量子約0.81。Ex~495nm，Em~515nm。任何可以檢測熒光素（fluorescein）的儀器，包括熒光顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡、流式細胞儀、熒光分光光度計或熒光酶標儀都可以用于該熒光探針的檢測。

DAF-FM DA是新一代NO檢測探針，與以往成功且應用廣泛的一氧化氮熒光檢測探針DAF-2 Diacetate相比較，具有多方面的改進：1）DAF-FM DA和NO加合反應形成的熒光產物在pH5.5以上不受pH影響；2）DAF-FM DA和NO加合反應形成的產物熒光更加穩定，不容易淬滅，這樣更加便于檢測；3）DAF-FM DA對一氧化氮的檢測靈敏度更高，其低檢測濃度可達到3nM，而DAF-2 Diacetate的低檢測濃度約為5nM。

CAS：254109-22-3

分子式：C25H18F2N2O7

分子量：496.42

純度：＞98%
儲存條件：-20℃避光，有效期12個月
實驗步驟：
(1)實驗開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)
(2)取約0.8g菌絲體(液體培養獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養就更好說了),在液氮中迅速磨成精細粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預熱的RNA提取液,顛倒混勻  
(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次
(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)
(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)
(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)
(7)10,000rpm,4℃離心20min
(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀
(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)
(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上
(11)12,000rpm,4℃離心20 min
(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥
(13)加200ul的DEPC處理水溶解
(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計掃描檢測RNA的質量
(在抽提過程中,若蛋白質含量或其它的雜質還較多,可以增加抽提次數)
操作步驟:
1. 勻漿處理:a.組織 將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進行勻漿處理。樣品體積不應超過TRIzol體積10℅。
b.單層培養細胞 直接在培養板中加入TRIzol裂解細胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應根據培養板面積而定，不取決于細胞數。TRIzol加量不足可能導致提取的RNA有DNA污染。
c．細胞懸液 離心收集細胞，每5-10×106動物、植物、酵母細胞或1×107細菌細胞加入1ml TRIzol，反復吸打。加TRIzol之前不要洗滌細胞以免mRNA降解。一些酵母和細菌細胞需用勻漿儀處理。產品僅用于科研
2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復合物完全分離。
3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質，脂肪，多糖或胞外物質（肌肉，植物結節部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時，上層有大量油脂應去除。取澄清的勻漿液進行下一步操作。
5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。
6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機相，上層為無色水相和一個中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。
7. 把水相轉移到新管中，如要分離DNA和蛋白質可保留有機相，進一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。
8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側和管底出現膠狀沉淀。移去上清。

原創作者：上海莼試生物技術有限公司

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